知识分享:mRNA的分离和纯化

  从细胞或组织中得到RNA是一种混合物,其中包括tRNA,rRNA和mRNA,其中RNA为75%~ 85%,tRNA占10%~16%,而mRNA仅占1%~5%,并且mRNA基因序列不同,分子量大小不均一,各基因的表达丰度也不一样。每克细胞可分离出5-10mg RNA。

  线’端的poly(A)尾巴。绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20-300个腺苷酸组成的poly(A)尾,这种结构为真核mRNA分子的分离和纯化,提供了极为方便的条件,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的实验理论就在于此。

  一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’端含有poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚(dT)(即oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过oligo(dT)纤维素柱吸附和解吸附,即可得到较纯的mRNA。

  需要用到的实验仪器:恒温水浴箱,高速冷冻离心机,紫外分光光度计,巴斯德吸管,玻璃棉,5ml一次性注射器。

  2、将悬浮液装入填有经DEPC水处理,高压灭菌后的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床约0.5-1.0mL,用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。

  3、用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素,直到流出液的pH值小于8.0。

  4、将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出,用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮,浓度约为0.1g/mL,保存在4℃待用。

  1、把总RNA液转到适合的无RNase离心管中,测定总RNA的浓度。如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL,则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL,总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。浓度调整以后,把RNA溶液置于65℃水浴加热5 min,然后迅速插在冰上冷却。

  1、mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合:用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素,取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中,盖上盖子,颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15min。oligo(dT)-纤维素与RNA所需量如下表。

  2、转移:取1个5ml注射器,用经过高温灭菌的玻璃棉塞紧注射器前端,注射器固定在无RNase的支架上,把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液加入注射器中,把塞子推到底部,收集流出的液体,即把含有未结合上的RNA液体收集到无RNase的离心管中(保留至确定获得足够的mRNA)。

  3、洗涤:根据表1所需洗涤缓冲液1的体积,直接用注射器慢慢吸取,温和振荡,充分悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素,推动塞子,用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260,当洗出液中OD值为0时准备洗脱。

  4、洗脱:根据表1所需洗脱液体积,用注射器慢慢吸取洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内,充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素,推动塞子,以1/3至1/2柱床体积分装到无RNase的离心管中。

  5、测定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脱液。在4℃条件下,2500g,离心2-3min,将上清转移至新无RNase的离心管中。

  6、沉淀:向上清液中加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.2), 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀后,-20℃条件下沉淀30min或放置过夜。

  7、离心收集:4℃条件下,12000g, 离心15min,小心弃去上清,用70%乙醇漂洗沉淀,4℃条件下,12000g, 离心5 min,小心弃去上清液。沉淀空气干燥10min。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水,立即用于后续实验,或用70%乙醇溶解,贮存于-70℃。

  1、整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境,且注意操作中的低温要求。

  2、用于纯化的总RNA样品须尽量保持RNA完整,不能被降解,获得完整mRNA质量的前提条件。

  4、RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5min,其作用:(1)破坏mRNA的二级结构,特别是poly(A+)尾处的二级结构,使poly(A+)尾充分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;(2)解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

  6、mRNA制备后,可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状,无明显区带,但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内呈弥散状。经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留,但一般来说不会对后续实验造成很大的影响,如果样品纯化后量足够,可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次,进一步提高其纯度。

  7、为防止mRNA降解,应避免多次冻融,可将mRNA少量分装后保存。 也可将mRNA用70%乙醇溶解,在-70℃保存,保存时间在一年以上。

  8、Oligo(dT)-纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3),放在4℃冰箱保存。经过预处理后可以重复使用。

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